よびiNOSの遺伝子の発現は、全てのプロテアソーム阻害剤は、0.2％DMSOをtainingメディア詐欺に溶解した。前述のようにチオグリコール酸誘発腹腔マクロファージを、8週齢のマウスから調製した。マクロファージは、トコフェロール、トコトリエノール、リボフラビン、または2時間、ケルセチンと、ウェル内で2時間付着させた。次に、すべてのウェルをCHAL LPSでlenged、4時間室温でインキュベートした。 4時間後、アッセイ混合物を20分間2000rpmで遠心分離した。細胞を回収し、全細胞RNAを、製造業者の説明書にるRNeasyミニキット協定を各ペレットから抽出した。各治療のRNAを転写し、得られたデータは、製造業者の指示に従って1ステップRT PCRキットを使用して、TNF aおよびiNOSの遺伝子発現を定量するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、分析した。報告されているように、LPS +デキサメタゾン、メビノリン、トコpherol、トコトリエノール、リボフラビンでそしてなしで処理腹腔マクロファージの生存率、およびケルセチンHCLは、トリパンブルー色素排除または3ジメチルthiozol 2,5ジフェニル臭化quantita電性比色アッセイによって決定した。統計分析は、統計ビュー?ソフトウェアは、対照群と比較して治療媒介効果の分析のために使用した。治療メント媒介性の差異は、双方向ANOVAを用いて検出し、F検定をsignifiカント効果を示した時、平均間の差異が最小有意差検定を保護フィッシャーズによって分析した。データは、テキストや表中のSDとして報告された。統計的有意水準を5％とした。鶏におけるTNF aと一酸化窒素の血清レベルに対する効果によって決定された20Sウサギ筋肉プロテアソームのキモトリプシン活性上のさまざまな化合物トコトリエノール、クエルチェスズ、リボフラビン、コーリーラクトン、アミロライドおよびDEXAのメタゾンの抗炎症作用の結果の影響、、最近報告されている。これらのコム?ポンドプロテアソーム活性を調節するかどうかを決定するために、20Sウサギ筋肉プロテアソームの活性のようなキモトリプシンは、5μMのから320μMの範囲の濃度でこれらの化合物による処置後に測定し、ビヒクル処理対照の活性と比較した。この研究の結果は、メビノリンとトコトリエノールのための5μMのと40μMの間の20Sウサギ筋肉プロテアソームのキモトリプシン様活性の用量依存性阻害を明らかにし、そして5μMの間のデキサメタゾン、ケルセチン、およびリボフラビン320 uMのへ。メビノリンとトコトリエノールの阻害効果は、80 uMの320μMの間のより高い濃度で逆転した。コーリーラクトンおよびアミロライドHCLトコフェロールが試験した濃度でに影響を及ぼさなかったのに対し、20Sウサギ筋肉プロテアソームのキモトリプシン様活性の用量依存性の増加を誘導した。表1に示す結果は、さまざまな濃度でのウサギ筋肉プロテアソームのキモトリプシン様活性20Sを阻害するためにこれらの化合物のいくつかの能力を実証する。その後の実験のために、私たちは、これらの化合物のそれぞれについての単一濃度にテストを制限した。これらの化合物の能力は、その後の実験のために選択された濃度でウサギ筋肉プロテアソームの様活性20Sキモトリプシンを阻害する私たちの初期の結果の確認を図2に提示されるいくつかのアクティビティデキサメタゾン、mevino LIN、トコトリエノール、リボフラビン、およびケルセチン、すべて有意に阻害プロテア、トコフェロールは影響を及ぼさなかった。 DEXAのメタゾン、メビノリン、トコトリエノール、リボフラビン、およびケルセチンで得られた対照と比較して、プロテアソーム阻害の程度は、それぞれ、31％、19％、28％、34％、および45％であった。最近の報告によると、20Sプロテアソーム詐欺テインそれぞれ十分に特徴付けられたプロテアーゼ部位、サブユニット×、Y、Zの表示キモトリプシン様、トリプシン様、およびポストグルタマーゼのactitivities、と三つの異なるサブユニット。これらの天然の化合物は、プロテアソーム阻害剤として作用することをしっかりCONするために、本発明者らは以下のように、ポストグルタマーゼプロテアソームACTIVのitiesトリプシン、キモトリプシン様にそれらの効果を測定した。 RAW 264 7細胞におけるこれらの酵素活性は、5μMのと40μMの間のconcen trationsで用量依存的に抑制された。リボフラビンは、この用量で14％の中程度INHIのbitionをもたらし、一方、ケルセチンおよびトコトリエノールは、対照と比較して40μMの濃度の様活性chymotryp罪の50％阻害を引き起こした。ケルセチンは、このように、これらの化合物は、プロテアソーム阻害剤として抑制を調節していることを私たちの以前の結果を確認、のようなトリプシンおよびリボフラビンおよびトコトリエノールの治療と比較して、ポストグルタマーゼ活動の最も強力な阻害剤であった。 LPSによるTNFαの産生に対する各種のプロテアソーム阻害剤の効果とNOは、RAW 264 7細胞デキサメタゾン、メビノリン、トコトリエノール、ribofla VIN、ケルセチンの抗炎症特性を刺激し、トコフェロールを治療するRAW 264 7マクロファージ
癌治療のポイントはR406の阻害の実施 を事前にすることによって調査されたLPS刺激後4時間および36時間、それぞれ培養上清中のLPSおよびTNF aまたは亜硝酸塩の測定による刺激に続いて、これらの化合物のそれぞれで1時間細胞、などが挙げられる。ケルセチン、デキサメタゾン、および有意に阻害したLPSは、それぞれ、対照と比較して、一方、トコトリエノールおよびメビノリン19％および17％の中程度の減少を生PD0332991,R406,CX-4945じたTNFの分泌を誘導したリボフラビン。 LPS STI mulatedマクロファージと私たちの以前の研究では、キモトリプシンプロテアソームの活性と同様に主に阻害ラクタシスチンは、大幅にTNFのプロ生産を阻害しなかったことを証明した。マクロファージはプレプロteasome阻害剤で処理した場合に達成することによってTNFの分泌を抑制するためである。したがって、さらなる研究は、前処理条件で行った。 RAW 264 7細胞に刺激LPSによるNOの生成をブロックするプロテアソーム阻害剤の能力を試験するとき、私たちはデキサメタゾンおよびケルセチンLPSはマクロファージを刺激したことを発見し、両方のプロテアソームの酵素プロテアソーム活性などのようなキモトリプシンおよびトリプシンを阻害されることがありました。 LPSは、さらに、マクロファージを刺激し、これらの阻害剤のような、トリプシンプロテアソームのキモトリプシン様活性の両方を抑制するという結論をサポートすることによりこのように、現在の実験において、プロteasome阻害剤の能力は、TNFの分泌を阻害する。また、LPSがマクロファージは、プロテアソーム阻害剤およびLPSで同時に処理された条件下で、マクロファージを刺激することによってTNFの分泌を抑制するためのプロテアソーム阻害剤の能力を試験した。私たちは、メビノリン、トコトリエノール、リボフラビンがブロックされている間、LPSとQUERのパルミチン酸セチル、デキサメタゾン、リボフラビン、トコトリエノール、またはメビノリンとの同時処理するPD0332991,R406,CX-4945ことにより分泌が阻害レベルに匹敵したTNFの阻害の程度は、最も効率的な阻害剤であったことがわかったNOだけ控えめの生産。トコpherolは、一酸化窒素のレベルに有意な影響を及ぼさなかった。 LPSにおけるNF Bの阻害に対するさまざまなプロテアソーム阻害剤の効果は、前述したように、NOレベルは加齢の間に増加しない血清および1潜在的な説明は年齢とともに、NF Bのシグナル伝達のdimin ished規制を必要とするRAW264の7個の細胞を刺激した。細胞質NF Bは、通常、その阻害剤、IBに結合した、および不活性状態に維持される。 NF BはIBは、リン酸化されたNAT変換ubiquitiときに活性化され、プロテアソームによって劣化する。 NF Bは核に移動し、TNF aおよびiNOSを含むプロ炎症性遺伝子の多様性のプロモーター部位に結合する。私たちは、resulの重要NFPD0332991,R406,CX-4945 Bの活性化と、高齢化プロテアソームによるIB分解の増加に起因する可能性が、加齢に伴う、NOレベルを増加させないという仮説を立てた。したがって、われわれは、具体的にはRAW2647細胞lated LPSのSTIMUの核抽出物中のNF Bを検出するためのPD0332991,R406,CX-4945EMSAアッセイを用いて、NF Bの活性化を阻害するさまざまなプロテアソーム阻害剤のABIL ITYを試験した。トコフェロールには効果がなかった培地対照と比較して、LPS誘発性のNF B活性化の有意な阻害が、トコトリエノール、mevino林、ケルセチン、デキサメタゾン、およびリボフラビンで達成された。したがって、これらのプロteasome阻害剤のそれぞれの能力が、それらのTNFの分泌を阻害する能力、およびNO産生を説明し得るNF BはACTIのvation LPS誘導を抑制することができる。前述したように、LPSでのPIBのレベル上の各種のプロテアソーム阻害剤の効果は、RAW2647細胞を刺激し、IBのリン酸化はresulの重要遊離とプロテアソームによるその分解をprereの前提条件
